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倒序阅读, 只看楼主, 0 发表于: 2010-11-23
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[交流分享] 用Protein柱纯化小鼠腹水单抗出现沉淀

本帖被 盗盗茶 设置为精华(2010-11-23)
事件:
自己制备了小鼠单抗(IgG2b),现在制备了大量的腹水,准备纯化。用GE公司的Protein G纯化在中和那步时,只要加中和的buffer,纯化后的抗体溶液就有浑浊的沉淀, Protein A也试过了,结果类似。先按公司给的protocol做,失败了,然后试了不同pH的洗脱液,也没找到合适的方法。大家有何建议?

参考一:
抗体纯化时就是这样,洗脱时常常会有一些浑浊。0.22um膜过滤去除就可以了。另外,减少浑浊的可能方法:一是中和buffer的pH由9改为8,预先加到收集瓶中;二是在收集瓶中加一些甘油,如果对你的后续用途没有影响的话。

参考二:
上周末去听了个培训班,根据讲师的说法proteinA、G系列对蛋白有损伤作用,而且这种作用是不可逆的,纯化出的蛋白也不适合长期存放。
他推荐用IMAC层析,可以在0.3~0.5M NaCl、pH8.0-8.1条件下上样,有利于蛋白稳定和减少非特异性吸附。然后用pH4.0的100mM的CH3COONa(含0.3~0.5M NaCl)pH梯度洗脱。如果纯度不够,可以再接一步疏水层析。

参考三:
关于用金属鳌合柱纯化IgG说的不是一天两天了,大约在5、6年前GE的一个会上,有位嘉宾就讲过此方面的内容。我听了觉得有些好奇,就装了个柱试试看。试验了不同的吸附和洗脱条件,最后结果是:
1、IMAC柱确实可以吸附样品中的部分IgG,但不能吸附全部,就是说有较多的穿透损失。
2、洗脱条件很窄,低浓度的咪唑皆可洗出,选择性不强。
3、想要通过改变吸附和洗脱条件来提高纯化的抗体纯度余地很小。
所以,我的结论是IMAC纯化抗体是鸡肋。如果没有A/G柱用,可以勉强一试,否则没有什么大意义。至于A/G柱纯化的抗体为什么不适合长期存放,我对此难以理解。全球的大抗体公司纯化几乎用的都是A/G柱,而且A/G柱的价格比IMAC、HIC要高很多,应该有它的理由。

参考四:
第一,我漏说了金属螯合层析填料要选用那些臂比较长的
第二,建议的洗脱方式是pH梯度,不是咪唑
第三,我们公司目前做的一个蛋白用proteinA纯化的,长时间放置后活性损失较大,但也不是说所有的都这样,只是作为一个提示
第四,我没有否认A/G的优点特异性好,快捷,方便,但是其缺点包括有失活可能,价格高,不适合所有抗体,时间长,载量小,而且目前耐碱的proteinA似乎只有一种,如何保证除热源?配基脱落也是一个问题。
第五,价格高,有其生产成本的因素,而且处于近乎垄断地位的商品有什么具体的定价标准,GE的东西都贵,买的人不还是多?

参考五:
第一,我漏说了金属螯合层析填料要选用那些臂比较长的
请教有商品化的介质吗,还是要自己做胶?能否给个名称,我也买点来试试。
第二,建议的洗脱方式是pH梯度,不是咪唑
是pH梯度还是分段pH?我感觉除了HPLC这样的精确系统外,梯度洗脱方式不适合实验室操作。原因有二:一是纯化设备,并不是很多实验室都有AKTA之类的好设备(虽然我有几台);二是自装柱达不到很高的均匀性,特别是用国产的空柱。所以做实验时拉梯度所得到的结果往往不能重复和放大。
第三,我们公司目前做的一个蛋白用proteinA纯化的,长时间放置后活性损失较大,但也不是说所有的都这样,只是作为一个提示
这个我不认为是纯化的原因。应该是保存条件和缓冲体系的选择因素。
第四,我没有否认A/G的优点特异性好,快捷,方便,但是其缺点包括有失活可能,价格高,不适合所有抗体,时间长,载量小,而且目前耐碱的proteinA似乎只有一种,如何保证除热源?配基脱落也是一个问题。
是啊,A/G太贵,sure介质简直就是天价。还好我纯化的蛋白对热源没有要求,但IMAC可以用NaOH清洗吗?或者说能用NaOH清洗的IMAC介质价格也不便宜吧,那些预挂Ni的IMAC介质能用多少次而载量下降不大?自己挂Ni?好想法,翻遍user manua,好,还真的有,那就做吧,咦,怎么和新介质性质不一样了?NaOH不耐了,DTT也不耐了,哇哦,原来再生方法是商业秘密。
不适合所有抗体,yes,IgM它就无能为力。
载量小,我不大同意。A/G在实际纯化过程中的载量大约在15mg/ml左右,IMAC和蛋白种类关系很大,但绝大多数在20mg/ml左右,相差不是太大。再考虑到吸附动力学的因素,A/G对抗体的吸附牢固都高于IMAC吧,所以我认为IMAC并不能提供高于A/G多少的载量。
第五,价格高,有其生产成本的因素,而且处于近乎垄断地位的商品有什么具体的定价标准,GE的东西都贵,买的人不还是多?
国产胶也有好东东,垄断正在逐步打破,价格比GE要便宜很多。做纯化的人非常高兴看到有和GE产品品质媲美的国产介质出现。

参考六:
请教有商品化的介质吗,还是要自己做胶?能否给个名称,我也买点来试试。
我不知道,我说过是引用别人的论述,根据他的论述不是自己做的
是pH梯度还是分段pH?我感觉除了HPLC这样的精确系统外,梯度洗脱方式不适合实验室操作。原因有二:一是纯化设备,并不是很多实验室都有AKTA之类的好设备(虽然我有几台);二是自装柱达不到很高的均匀性,特别是用国产的空柱。所以做实验时拉梯度所得到的结果往往不能重复和放大。
学校的设备一般都比公司好,只是要求高,不到最后不让用,公司做纯化没有设备?分段还是连续都要摸条件。阶段洗脱的确重复好,难道所有的蛋白能阶段洗脱分开?
这个我不认为是纯化的原因。应该是保存条件和缓冲体系的选择因素。
这个是我根据老师的论述做的推断,就像你有自己的推断
是啊,A/G太贵,sure介质简直就是天价。还好我纯化的蛋白对热源没有要求,但IMAC可以用NaOH清洗吗?或者说能用NaOH清洗的IMAC介质价格也不便宜吧,那些预挂Ni的IMAC介质能用多少次而载量下降不大?自己挂Ni?好想法,翻遍user manua,好,还真的有,那就做吧,咦,怎么和新介质性质不一样了?NaOH不耐了,DTT也不耐了,哇哦,原来再生方法是商业秘密。
不适合所有抗体,yes,IgM它就无能为力。
老师建议我们不要盲信说明书,他建议的再生方法第一步会洗掉所有的Ni,第二步(省略)。IgM我忘记他具体说的了,但是有一种方法是利用分子筛的吸附作用,这点我初学还从来没听过。
国产胶也有好东东,垄断正在逐步打破,价格比GE要便宜很多。做纯化的人非常高兴看到有和GE产品品质媲美的国产介质出现。
没人说不好,而且看不出来和我说的有什么联系。照你的说法A/G价格高就好,那么介质的市场份额又说明什么?
你举了一个类型一样方法不一样的结果就能把别人的方法说成鸡肋?

参考七:
用G/A柱做,面临的配基脱落和价格问题是必须要考虑的问题。
相对而言,我本人喜欢使用离子交换柱+疏水。纯度等方面均可以达到要求。
但用该方法,基本上每一种单克隆抗体都需要摸索条件。
主要是进行条件的细微调节。

参考八:
小鼠腹水么 你是实验室用用的吧
盐析复溶以后电导很高 只能跟疏水或者亲和 当然GF也可以-c-
你看你哪里有疏水介质么 可以考虑pheol来纯化一下
Protein G洗脱的pH低,不是有沉淀么,所以不能用这个办法
当然透析一下 电导降低后 上离子柱也可以的

参考九:
除了特异性的竞争洗脱剂和酸性低pH洗脱之外,较通用性的洗脱方法还有高pH法,如100mM的碳酸钠;或2-3M的硫氰酸钾、硫氰酸钠等。这两种方法我都尝试过,对某些抗体很有用。另外,还听说过用低浓度变性剂,如1-2M尿素洗脱的,不过我没试过。

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