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倒序阅读, 只看楼主, 0 发表于: 05-04
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[交流分享] 免疫组化防脱片处理

防脱片的处理

  


   脱片是免疫组织化学中经常遇到的问题(尤其是脑组织冰冻切片),一般来说脱片主要有以下几种原因:

   1. 组织固定、脱水、透明不充分
   2.组织切片过厚
   3.组织切片有折叠
   4.过度的热抗原修复(高压、微波、水煮)处理或抗原修复液的pH偏高
   5.操作过程中,冲洗方法不正确等
   在实际操作的过程中,除了要注意以上几点之外,防脱片的应用是很有必要的,市售的防脱载玻片一般为正电荷玻片,不同品牌之间品质存在差异,而即使是较好的PREMIER玻片其防脱效果有时也不能令人满意,而且假货较多,因此,实验室常常需要自己处理防脱载玻片,步骤如下:
1. 玻片的酸处理
   使用实验室常用的次强酸清洁液(重铬酸钾120g,浓硫酸200ml,蒸馏水1000ml)浸泡玻片24小时,流水充分冲洗后在用蒸馏水冲洗三遍,置于95%乙醇中浸泡12小时,取出放烘箱中烤干或自然风干。
2. 黏附剂的使用
  目前常用的黏附剂有三种:明胶-硫酸铬钾,APES(3—氨丙基—乙氧基甲硅烷),多聚左旋赖氨酸(poly-1—lysine)
(1)明胶-硫酸铬钾,这种方法十分简便实用,不仅用于传统染色,而且能够用于免疫组化、原位杂交等检测,目前实验室大多数时候可以常规用该黏附剂。该方法的美中不足是在pH值高于8.0的碱性环境中(如使用PH9.0的TE抗原修复液)加温到80度以上,切片还是容易脱落,因此选用此种黏附剂时宜采用PH6.0的柠檬酸钠抗原修复液。
配制方法:将5g明胶溶解于1L热的蒸馏水中,待冷却后加入0.5g硫酸铬钾充分搅拌溶解,将玻片浸泡其中30分钟,取出自然晾干后再次浸泡30分钟,晾干装盒备用。如果效不能满足需要,可将浓度提高一倍,即10g明胶+1g硫酸铬钾/L。(更高的浓度本实验室未做尝试)
(2)APES(3—氨丙基—乙氧基甲硅烷)要用丙酮稀释,而丙酮有导致肝硬化的作用,需注意人身防护。该方法弥补了部分高温碱性溶液脱片的问题。另外,有说法认为已经贴好的片子如果有脱片现象,可用此法浸泡3分钟,晾干后进行下一步,但经本实验室验证效果并不好。
配制方法:将APES用丙酮稀释(APES:丙酮=1:50),洗净的玻片浸入溶液中20秒,取出控去多余溶液,再浸入纯丙酮或蒸馏水中洗去未结合的APES,晾干装盒备用。(注意:此溶液需现用现配,因此尽量一次批量处理尽可能多的玻片以充分利用。)
(3)多聚左旋赖氨酸(poly-1—lysine),这种方法相当昂贵。但是,如果进行高压碱性修复,可能总体上效果是最佳的。普通组化实验和免疫组化酸性修复(大多数的情况)则没有必要常规使用。多聚赖氨酸一般常见的分子量有70,000~150,000,150,000~300,000和>300,000,分子量越大,黏附力越强,但相对完全溶解较困难。

配制方法:按照0.1mg/ml的浓度用双蒸水溶解多聚赖氨酸,将洗净的玻片尽在溶液中5分钟(增加时间不会提高粘附效果),自然晾干装盒备用。如果要节约试剂,可使用直接涂布法,用移液器吸取溶液涂布于玻片上需要贴片的区域,可随意控制面积大小,一般用量控制在20μl/cm2。(注意:1.浸泡法每100ml多聚赖氨酸溶液包被的片子一般不超过100张,包被过多会降低粘附力。2.多聚赖氨酸溶液4℃保存,一年内稳定。3.冰箱内取出的多聚赖氨酸溶液使用前要先恢复到室温方可正常使用。)

内容来自上海钰森生物官网
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